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上颌窦提升术后骨形成的早期机制

背景:前期研究发现了在窦提升后上颌窦内可预见的骨形成,然而我们尚不清楚骨是在何处以何种方式形成。

目的:本研究的目的是在组织学和免疫组化方向研究灵长类上颌窦提升后的早期成骨过程。

材料和方法:本研究包括9只成年雄性卷尾猴(Cebusapella)。

8只经侧壁开窗行双侧上颌窦提升术。

两侧上颌窦腔内各植入1个氧化的牙种植体。

其中4只的一侧上颌窦不做额外处理,对侧上颌窦填充胫骨来源的自体骨移植材料。

2只的双侧种植体植入到提升后的上颌窦粘膜下。

2只的上颌窦黏膜被完全去除。

剩余1只未经手术的动物提供原始的组织情况作为对照。

在10或45天后将实验动物安乐死,取出上颌窦和种植体进一步处理后于光学显微镜下观察,经脱钙切片后行免疫组化分析。

结果:无论时间和手术方式如何,骨形成都从窦底部开始,在提升后的黏膜下沿种植体表面向肉芽组织中生长。

在与窦粘膜直接接触的情况下未观察到骨形成。

在所有组中靠近固有层的浆液腺中都观察到骨桥蛋白的明显表达。

 结论:上颌窦提升术后无论是否额外行骨移植术,骨形成于上颌窦底壁并沿种植体表面进入提升的空间中。

在本研究中,上颌窦提升术过程中上颌窦黏膜似乎并不具有成骨诱导潜能。

关键词:骨形成,CD68,口腔种植,巨噬细胞,骨钙素,骨桥蛋白,上颌窦提升

介绍

上颌后牙缺失中垂直骨高度不足是骨内种植体修复需要面对的一个常见临床问题。

在这种情况下,恢复骨高度对于种植体的植入和骨结合来说通常是必要的。

文献中已经描述了不同的技术,包括自体骨移植、骨替代材料或者行上颌窦提升术后同期或延期植入种植体。

Lundgren和他的同事们研究发现经侧壁开窗行上颌窦提升术同期植入种植体后的骨形成是可以预期的。

一项动物实验研究也通过组织学手段证实了该结果以及骨形成和种植体的骨结合。

其他几篇研究也证明了在剩余骨高度不足的情况下也有类似的可预测的结果。

然而,窦粘膜(Schnederianmembrane)在上颌窦提升术后的骨形成中发挥作用的机制尚不清楚。

有研究结果表明,上颌窦来源的骨祖细胞在上颌窦提升术中发挥了重要作用。

支持和反对上颌窦黏膜具有骨诱导潜力的研究都有存在。

在一项体外研究中,Srouji和他的同事观察到了上颌窦黏膜固有的成骨潜能的表现,从而可能促进上颌窦提升术中的骨再生。

与此相反,一项近期对灵长类动物的研究推断,上颌窦黏膜对上颌窦提升术同期植入种植体后的骨形成影响不大。

本实验性研究的目的是从组织学和免疫组化角度研究灵长类动物上颌窦提升术10和45天后上颌窦的骨形成过程。

材料与方法

本研究包括9只成年雄性卷尾猴(Cebusapella),体重在2500-3050g之间(平均2840g)。

其中8只接受了实验性手术,1只作为阳性对照。

术前4个月拔除实验动物双侧上颌第一、第二、第三前磨牙。

实验的灵长类动物使用剂量为10mg/kg体重的盐酸氯胺酮(Ketamink,CristaliaProdutosQuímicosFarmaceuticosLtda,Itapira,SaoPaulo,Brazil)作为镇静剂行肌肉注射。

全身麻醉使用剂量30mg/kg体重的硫喷妥钠(Lab.HospiraS.p.A.,Liscate,Milan,Italy)。

麻醉增补使用当地管理的含1:100000肾上腺素的2%盐酸卡波卡因(DFLLtd,RiodeJaneiro,Brazil)。

术前预防包括0.12%氯己定溶液(Periogardk,Colgate-PalmoliveLtd,SaoPaulo,Brazil)清洗术区,手术过程在无菌环境下进行。

手术

所有动物都接受经侧壁入路的双侧上颌窦提升术,共4名外科医生进行手术。

行正中切口和垂直减张切口后,翻开黏骨膜瓣,直达双侧上颌后部缺牙区牙槽骨,在连续盐水灌注下使用往复微锯(Aesculap,BBraunMelsungenAg,Melsungen,Germany)作一矩形可移位骨瓣,从窦粘膜上取下骨窗储存于盐水溶液中。

在暴露窗口边缘切开施耐德氏膜并向下延伸暴露窦底壁。

在每个时间组(10和45天)中各有一例上颌窦在手术中出现窦粘膜穿孔。

这些动物因此被分到黏膜去除组内,从而保证其他所有病例中上颌窦黏膜提升术后的完整性。

每个时间组(10天和45天)中各有2只动物,共计4只在双侧剩余牙槽骨中各植入一个定制的氧化种植体(TiUniteMarkIII,BrånemarkSystem,NobelBiocareAB,Göteborg,Sweden)并突入上颌窦腔内,种植体直径3.75mm,长8.5mm。

未登记种植体突入上颌窦腔内的长度。

所有实验位点的临床剩余骨厚度都很薄(2-3mm),因此种植体的大部分都突入到窦腔内。

但是所有种植体都能获得良好的初期稳定性。

每只动物的左侧上颌窦种植体周围提升的粘膜下都使用由骨刮刀(Biomet3i,Indiana,USA)从胫骨近端刮取的骨质进行额外的骨移植。

而右侧则没有放置任何骨移植材料。

在两只动物中,每个时间组各有一只,其种植体植入于双侧上颌窦提升后未经骨移植的上颌窦黏膜下。

在两只动物中,每个时间组各有一只,完全去除双侧的种植体周围上颌窦黏膜。

(表1)骨窗使用组织胶(Indermil,HenkelKgaA,Düsseldorf,Germany)复位,种植体上放置覆盖螺丝,翻转黏骨膜瓣并用Vicryl4-0(Ethicon,WestSomerville,NJ,USA)缝合。









表1:实验动物的处理程序,手术方式和分组









固定程序

10日后处死4只动物,45日后处死剩余4只,获得16个上颌窦。

用硫喷妥钠深度麻醉动物,升主动脉灌注PH7的0.9%生理盐水,随后灌注2000ml溶解于0.1M醋酸钠缓冲液的4%多聚甲醛溶液(PH6.5,4℃),最后灌注2000ml溶解于0.1M硼酸钠缓冲液的4%多聚甲醛溶液(pH9.5,4C)。

从每个时间组的4只动物中取得标本于甲基丙烯酸甲酯中进行脱钙处理。

对这些标本进行组织学和组织形态学分析。

从每个时间组的另外4只动物中取得标本固定于4%甲醛溶液中,0.1M乙二胺四乙酸脱钙至足够柔软,切片并准备免疫组化染色。

第9只动物的上颌窦作为对照,以相同的方法进行切片染色。

选择切面为种植体最厚处的切片进行组织学检查。

考虑到金属种植体部分无法分析,免疫组化研究分析最接近种植体表面,染色效果最佳并且没有或几乎没有折痕的切片。

因此免疫组化切片描述了金属表面外5-20μm的情况。

组织学

组织学检验的样品制备遵循Palma和其同事的原则。

标本在一系列乙醇脱水后硬丙烯酸树脂包埋(LRWhite,LondonResinCompanyLtd,Berkshire,England)并在干燥加热炉中60℃下聚合。

塑料块在切片机上切片,厚度约为40μm(Microslice2,UltratecInc,SantaAna,CA,USA),手动研磨至约15μm厚,最后用甲苯胺蓝/吡罗红染色。

免疫组化

标本以石蜡包埋,水平连续切片至5μm,正电荷防脱载玻片(GerhardMenzelGmbH,Braunschweig,Germany)收集。

随后标本于二甲苯中脱蜡,乙醇梯度浓度下再水化。

置于10%马血清中孵育90分钟,加入1:100稀释的骨钙素一抗(OC;Antibodies-onlineInc,Atlanta,GA,USA)、骨桥蛋白一抗(OP;Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)、巨噬细胞一抗(LifeSpanBiosciencesInc,Seattle,WA,USA)及CD68一抗(DakoDenmarkA/S,Glostrup,Denmark),恒温箱(4℃)中孵育过夜。

部分切片中没有加入一抗,作为免疫组化试验的阴性对照。

从未手术动物中获得的原始组织切片作为阳性对照。

磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗后,0.3%过氧化氢溶液阻断内源性过氧化物酶活性。

随后PBS冲洗,应用生物素化的二抗(1:100)和抗兔免疫球蛋白G(Vectorlaboratories,Burlingame,CA,USA),孵育90分钟后再次PBS冲洗。

加入生物素-亲和素复合物(VectastainEliteABCKit,VectorLaboratoriesInc),黑暗下孵育30分钟。

最后将标本应用DAB过氧化物酶底物试剂盒,3,3-二氨基苯胺(VectorLaboratoriesInc)和30%过氧化氢处理2分钟。

Mayers苏木精(HistolabProductsAB,Göteborg,Sweden)染色,自来水清洗并经由两个独立方研究员于光镜下分析,最后由第三方进行比较。

伦理原则

本项动物实验是遵循巴西环境保护研究所的规定并且经巴西阿拉萨图巴圣保罗州大学牙学院动物伦理委员会在2009年批准(FOA087/95)下进行。

结果

磨片的组织学

典型的实验区磨片包含种植体部分,它穿透一层薄的边缘骨(2-3mm),大部分螺纹突出到窦腔(图1A)。

在一些标本中,靠近种植体的一侧出现一个垂直的隔膜,为了结果的一致性,实验采用了未出现隔膜的另一侧。

根据后续的处理和时间的不同,在这些区域观察到上颌窦黏膜和数量不同的肉芽组织、骨和骨髓组织。

上颌窦膜提升:10天的标本显示了上颌窦黏膜成功的抬升,形成了一个隔离区,被边缘骨内膜表面、上颌窦膜与至少种植体的一侧围绕(见图1A)。

隔离区主要由肉芽组织与骨片填充。

靠近种植体的骨内膜表面可见骨形成,并侵入肉芽组织中(图1B)。

在高倍镜下,可以观察到成骨细胞在现有的骨、骨片上形成矿化组织,并在血管附近聚集成单独的细胞岛(图1C)。









图1:A-C,上颌窦提升后10天的标本在光镜下观察。

A,种植体(i)穿过边缘骨并突入窦腔内(SC)。

研究的观察区(ROI)被种植体、上颌窦黏膜和边缘骨围绕。

上颌窦黏膜(箭号示)。

B,放大图1A,在现存骨(B)、骨片(BF)上可见新骨形成(深蓝色),并侵入肉芽组织(GT)内形成单独的岛。

种植体(I)表面可见骨形成。

C,高倍镜下的1B,显示成骨细胞岛和血管(V)附近的骨形成(箭号示)。
 

 









在种植体顶端附近提升的上颌窦黏膜上未见成骨活动(图2A)。

然而,在标本的远端上颌窦黏膜与骨内膜表面相区分处可见单独的骨形成(图2B)。

在剥落的骨内膜上也可观察到成骨细胞活性。

在边缘骨上部的种植体螺纹部分可直接观察到新骨形成(图1B)。

45天的标本上颌窦提升区域可见发育良好的骨组织和骨髓组织(图3A)。

而标本的中心则由细长的骨小梁、疏松结缔组织和脂肪细胞组成。

上颌窦黏膜上可见新形成的骨成线形排列。

在呼吸上皮朝向上颌窦腔的区域和骨衬里内有深染的腺体组织存在(图3B)。

牙槽嵴顶区骨与种植体表面也有接触。

而种植体顶端与致密纤维组织接触并最后与上颌窦黏膜接触。









图2:A-B,上颌窦提升后10天采集的标本的细节。

A,顶端螺纹处(i)的上颌窦黏膜(箭头示)。

无论实在黏膜附近还是肉芽组织(GT)内都没有骨形成的迹象。

B,提升的上颌窦黏膜(SM)与边缘骨(MB)之间的单独的骨形成(箭头示)。

在边缘骨内膜表面可见新骨形成(深蓝色)。
 









 







图3:A-B,光镜显示上颌窦提升后45天的磨片标本。

A,新的松质骨(箭头示)、疏松结缔组织(LCT)与脂肪细胞共同填充提升后的上颌窦黏膜下区域。

新骨沿着上颌窦黏膜(SM)轮廓分布。

I=种植体,MB=边缘骨。

B,图3A的细节显示了上颌窦黏膜(SM)与新形成骨(B)和骨髓(BM)之间的关系。

黏膜下方可见深染的腺体组织。
 









去除上颌窦黏膜组。

10天的标本显示出与上颌窦提升标本相似的形态,但是无上颌窦黏膜。

因此,种植体侧面的大部分区域被肉芽组织填充,在骨内膜和种植体表面可见新骨形成(图4A)。

在45天标本上可见沿种植体表面形成一层新的窦粘膜。

仅有靠近骨内膜表面以及冠方螺纹的一小块区域有新骨填充。

窦粘膜与更多的顶端螺纹及种植体顶部接触(图4B)。









图4:A-B光镜下观察移除上颌窦黏膜后10天(A)和45天(B)组。

A,观察区域由肉芽组织(GT)填充。

在种植体(I)及其附近可见新骨形成。

B,沿着种植体的轮廓(箭头示)形成了一层新的黏膜。

在种植体前两个螺纹处(I)可见新骨形成。

MB=边缘骨。
 









上颌窦提升合并骨移植组。

10天的标本显示含有移植骨颗粒的肉芽组织填充了提升后的黏膜下区域(图5A)。

与其他组一样,在骨内膜及种植体表面可见骨形成。

移植的骨颗粒处未见骨形成或骨吸收。

45天的标本显示与上颌窦提升组相似的形态。

然而在这些标本中,种植体顶端附近可见更多致密的纤维组织(图5B)。

此外实验还发现了边缘骨吸收,因此该区域新形成的骨组织和骨髓组织较少。









图5:A-B,光镜下观察上颌窦提升加骨移植后10天组(A)和45天组(B)。

A观察区域被肉芽组织与移植骨颗粒填充。

MB=边缘骨,I=种植体。

B,标本中出现边缘骨吸收。

新骨级骨髓组织(BMT)在上颌窦粘膜(箭头示)下出现。

种植体顶端(I)可见大面积致密纤维组织(FT)。

MB=边缘骨。
 









免疫组化观察

骨钙素(OC)。

OC在10和45天标本中都明显表达。

在10天标本中,OC主要见于固有层表面及复层上皮层中的内皮细胞(图6A)。

在10天和45天标本中,在上颌窦提升与上颌窦提升+骨移植标本中可见更为明显的骨质染色,而在移除上颌窦黏膜的标本中染色较浅。

在45天标本中,除了复层上皮外未见固有层染色。

在剩余骨的深部可见更为明显的表达(图6BC)。

三种手术干预组都可见相同染色的骨细胞腔隙、骨髓以及淋巴斑块的存在。

一般来说45天组中OC的表达更强。

阴性对照未见染色,并且在原始组织切片中,少量细胞表现出OC的表达。









图6:A-C,骨钙素(OC)染色。

A,固有层(LP)表面和复层上皮(10天组,去除黏膜)中的内皮细胞可见OC表达(箭头示)。

B-C,除了复层上皮外,固有层未见OC染色(箭头示)。

在剩余骨(RB)的深部可见更为明显的表达。

B,45天去除黏膜组。

C,45天上颌窦提升加骨移植组。
 









骨桥蛋白(OP)。

所有10天组的标本都可见明显的OP表达。

固有层中的腺体和黏骨膜都表现出明显的表达(图7A)。

且OP的表达似乎随着与种植位点的接近而提高。

对于所有手术处理后的标本,与10天组相比,45天组OP的表达更加显著。

紧邻种植位点的固有层腺体表现出明显的染色(图7B)。

同一切片中其他与种植位点不相邻的位置,腺体和其他部位未见表达(图7C)。

阴性对照组未见染色。

原始组织切片固有层内很少见单独细胞以及OP的表达。

有意思的是原始组织切片的固有层明显更薄。

(图8A)







图7:A-C,骨桥蛋白(OP)染色。

A,上颌窦提升后10天组。

上颌窦黏膜固有层的粘膜腺体(MG)的OP表达(箭头示)。

B,上颌窦提升加骨移植后45天组。

临近种植位点的固有层粘膜腺体(MG)可见强OP染色(箭头示)。

C,上颌窦提升加骨移植后45天组(图7B同一切片)。

非种植位点未见OP表达。

LP=固有层。
 









巨噬细胞。

在10天组的标本中观察到单个分离细胞的微弱表达。

分离细胞散布于固有层及下层骨质中(图8A)。

在45天组合阴性对照组中未见染色。

有趣的是未经手术动物提供的原始组织标本可见局部巨噬细胞聚集及分泌物。

上皮层相对较强的巨噬细胞染色表明了慢性鼻窦炎的存在。

 CD68。

CD68在上颌窦提升后10天的标本固有层中的一些细胞中表达,以及在上颌窦提升加骨移植后45天组和去除黏膜组的剩余骨中表达(图8C)。

阴性对照组和原始组织标本均未见染色。









图8:A-C,原始切片(A)显示的固有层(LP)明显更薄。

B,上颌窦提升后10天组。

散布于固有层(LP)级下层骨质中的分离细胞,巨噬细胞微弱表达(箭头示)。

C,上颌窦提升加骨移植45天组。

CD68的表达仅在剩余骨(RB)中的一些细胞中可见。
 









讨论

上颌窦黏膜在上颌窦提升术中对早期骨形成的作用和影响尚不清楚,且支持和反对上颌窦黏膜骨诱导潜力的研究都存在。

目前的组织学研究评估了灵长类上颌窦提升及种植体植入上颌窦后的早期事件。

观察到骨形成从靠近种植体的上颌窦底壁开始。

在10天内,我们观察到编织骨骨小梁侵入肉芽组织中,这些肉芽组织则占据被提升后的上颌窦黏膜、种植体表面以及上颌窦底壁密质骨围成的隔离区。

在45天内,发育良好的骨及骨髓组织填充了提升后的空间,可见新形成的骨沿上颌窦黏膜排列并且接触种植体表面。

没有形态学证据证明上颌窦黏膜本身可以诱导骨形成。

然而免疫组化分析显示直接与提升的上颌窦黏膜连接并靠近种植体的固有层深部的浆液腺中有明显的OP表达。

然而,正如将进一步讨论的那样,这一发现的意义尚不清楚。

不同时间组中愈合过程的表现及组织学结果证实了Scala和他同事的实验成果,该实验与本次研究使用了相同的实验动物。

Scala使用了一个仅进行上颌窦提升的试验模型,在经侧壁入路后骨窗被推入上颌窦腔内,并同期植入种植体而不进行额外的材料移植。

愈合时间为4、10、20、30天。

组织学评估显示植入位点的骨形成开始于剩余骨并呈冠状向种植体顶端延伸,其中最顶端的部分没有骨质覆盖。

该研究的结论是,上颌窦膜在上颌窦提升术中可能既不产生直接影响也无成骨诱导性能。

Palma和他的同事[5]对4只卷尾猴进行了与本研究相同的经侧壁开窗上颌窦提升术。

目的是比较在上颌窦提升术同期植入种植体同时进行或不进行自体骨移植情况下的组织学结果,以及调查两种不同的种植表面在这种情况下的作用。

Palma发现在6个月的愈合期后,根据种植体稳定性以及种植体与骨接触情况比较,上颌窦提升和骨移植两者间没有差异,同时他们还发现与切削种植体相比,氧化种植体在骨-种植体接触方面结合效果更佳。

他们还发现新骨通常堆积在靠近种植体与单独凝结位点的上颌窦黏膜接触的最高部位,这表明了黏膜的成骨诱导潜能。

他们的结果与一些其他研究人员的结果一致(Srouji和他的同事)。

他们使用动物模型来研究上颌窦提升过程并演示碱性磷酸酶活性的升高及上颌窦内成骨标记物的变化,从而支持上颌窦黏膜在成骨过程中发挥作用的理论。

在一项体外研究中,实验用了原始的猪上颌窦黏膜,Gruber和他的同事[15]检测了STRO-1(细胞表面蛋白)、骨形态发生蛋白(BMP-6和BMP-7),碱性磷酸酶活性以及冷冻切片的OC表达量。

用BMP-6和BMP-7刺激上颌窦黏膜细胞增加了成骨分化。

这些结果表明,上颌窦黏膜中存在间充质祖细胞,理论上可以分化成成骨细胞并参与骨形成。

在本研究中,免疫组化分析使用了抗OC、抗OP、抗巨噬细胞(MP)和抗CD68的一抗。

OC是由分化良好的成骨细胞分泌的,并在早期骨形成中发挥作用,因此被用于衡量成骨能力的成熟程度。

OP已被认为是骨重建的一个重要因素并且促进成骨细胞对细胞外基质的附着。

CD68是巨噬细胞谱系,包括破骨细胞的细胞标记物,并且研究中显示其与RANKL蛋白密切相关。

关于免疫组化标记的研究,在选择合适的抗体时存在一个问题,即抗灵长类动物可用的商业抗体存在限制。

我们希望能够获得直接关于血管生成的特异性细胞标记物,如被认为是骨形成过程中血管生成的关键调控因子之一的VEGF型。

目前,OC的表达主要见于内皮细胞中,这些内皮细胞分布于10天组的固有层中及在45天组中更明显的剩余骨的深部。

Schwarz和他的同事在一项狗的实验性初步研究中证实了在种植体周围骨愈合早期OC的表达。

研究人员发现在最初的愈合过程中,OC表达量随着时间增加,并且种植体周围的骨重建开始于4-7天之间,且与OC的第一个信号相关。

两周后,研究人员发现了OC与种植体周围进行中的骨形成的直接关系。

与我们的研究相反,Schwarz的研究有一个优势,即切割包括钛种植体在内的周围组织,从而直接在种植体表面和周围组织的结合界面上研究这一情况。

Sohn和他的同事对兔进行了一项实验性研究,用免疫组化分析评估经或不经骨移植(Bio-Oss,GeistlichPharmaAG,Switzerland)时上颌窦的骨形成。

使用的标记物是增殖细胞和抗原、I型胶原和OC。

在未移植部位,新骨的表面的剩余骨质中及在提升一周后的上颌窦黏膜表面可见OC的表达。

随着时间的增加,OC的明显表达主要见于新形成骨的成骨细胞周围、复位的骨窗周围及提升的上颌窦黏膜表面,其外观在2、4、8周内相对不变。

他们的进一步研究表明未接受骨移植的部位可见更快的骨形成。

总得来说,尽管Sohn没有描述剩余骨的深部及内皮细胞周围的OC表达,但是其免疫组化的观察结果与本研究完全吻合。

然而有趣的是临床相关性或意义上的不确定性,即10天和45天组中骨桥蛋白的深染。

在种植体附近与提升的上颌窦膜直接连接部位的固有层深部浆液腺有明显的表达,并在组织学磨片中得到证实。

在同一标本的其他部分的腺体中未发现任何OP的表达,这也在其他的实验性研究中得到证实。

Forsgren和他的同事得出结论,在切除兔上颌窦黏膜表层2周后发生上皮再生,同时组织学实验还发现了包括骨重建以及固有层中存在的不规则的腺体在内的反应性细胞过程。

Moreno-Melgarajo的结论是兔的施耐德氏膜固有层含有浆液性腺体和血管。

他们进一步得出结论,去除黏膜将导致腺体数量的减少。

对于人类来说,固有层的黏膜下腺体数目的增加通常与窦粘膜的病理变化有关。

然而这些发现的临床意义尚不明确,且并未显示施耐德氏膜的直接成骨诱导作用。

然而手术干预似乎影响了黏膜并且在与手术部位紧密结合的情况下引起反应性反应,这也得到了之前提及的一些研究的支持。

本研究中MP和CD68的表达相对有限。

在10天组标本的单个细胞中观察到了对MP的表面染色,在45天组标本中未见吸收。

一个可能的解释是在愈合过程中,早期免疫和炎症反应发生于10天之前。

讨论

无论接受或不接受额外的骨移植,上颌窦提升术后骨形成都开始于上颌窦底部,并沿种植体表面延伸进入提升区域。

移除上颌窦黏膜将导致骨形成减少。

在提升后的上颌窦黏膜下靠近种植体部位的固有层深部浆液性腺体中,所有组都可见明显的OP表达。

目前的研究似乎并没有证实上颌窦黏膜在上颌窦提升过程中具有骨诱导潜能。
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